一、试剂盒产品信息  

二、操作步骤 

1. 提取类器官原代

1. 取材后将肺组织拍照并登记信息，迅速放在4 ℃预冷的含有组织保存液Ⅰ的取样管中。
2. 将组织放入培养皿中，利用清洗液Ⅱ清洗3-5次后，利用眼科剪将肿瘤组织剪成体积约为 1~3 mm³的组织块。
3. 加入适量肺组织消化液Ⅲ，37 ℃震荡消化10-20 min （该过程随时观察消化情况）。
4. 取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或70 μm以下的细胞簇后， 加入三倍体积清洗液Ⅱ终止消化。
5. 使用100 μm筛网进行过滤，收集滤液后在300 g 离心 5 min。弃上清后，添加清洗液Ⅱ重新重悬离心。
6. 观察收集到的组织体积，添加 25-30倍组织体积的基质胶重悬铺板。
7. 以24 孔细胞培养板为例，每孔点胶25 ul基质胶混合物进行铺板（将基质胶始终置于冰上）。
8. 将铺好的培养板放入 37℃培养箱中 10- 15 min 成胶， 添加肺类器官培养基Ⅳ（恢复室温）进行培养。

2. 类器官传代培养

1. 吸去培养基，每孔添加 1-2 ml 类器官传代缓冲液Ⅵ。轻柔吹打基质胶，收集在 15 ml 离心管中，4 ℃ 静置10 min。
2. 如果类器官数量不足或体积较小，则离心 5min 弃去上清，添加适量类器官传代缓冲液Ⅵ，重悬移入1.5 ml 离心管，300 g离心5 min，弃去液体，进行第4步。
3. 如果类器官数量较多或体积较大，则离心5 min弃上清，添加适量类器官传代消化液Ⅴ。消化2-3 min，添加类器官传代缓冲液Ⅵ终止消化，离心 5 min 弃去混合液，添加适量类器官传代缓冲液Ⅵ，重悬移入1.5 ml离心管，300 g离心5 min，弃去液体，进行第4步。 
4. 类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔25 μl基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15 min，最后添加500 μl 肺类器官培养基Ⅳ。

3. 类器官冻存 

1. 吸去培养基，每孔添加 1-2 ml 类器官传代缓冲液Ⅵ。轻柔吹打基质胶，收集在15 ml 离心管中，4 ℃ 静置10 min。
2. 离心5min弃去上清，添加适量类器官传代缓冲液Ⅵ，重悬后300 g离心5 min，弃去上清。 
3. 添加适量类器官冻存液Ⅶ，轻柔吹打重悬。在-80 ℃ 中进行程序降温，最后可移入液氮长期保存。

4. 类器官复苏

1. 提前在15 ml 离心管中加入7-10 ml 类器官传代缓冲液Ⅵ。
2. 从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于37 ℃水浴锅中融解。
3. 将溶解后的类器官细胞快速转移至 15 ml离心管，使用移液管轻轻吹打6-8次，300 g  离心5 min，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量类器官传代缓冲液Ⅵ，重悬移入1.5 ml 离心管，300 g离心 5 min。
4. 重悬基质胶，每孔 25 μl 基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15 min 成胶，添加500 μl肺类器官培养基Ⅳ。

三、注意事项：

  1. 本产品仅限于科学研究使用，不得用于临床诊断等其他用途。  

  2. 为了您的生命安全，请遵守实验操作规范，穿实验服并佩戴一次性手套操作。